4.1.2.2 分离培养

　　选取叶上幼小病斑一个，连同健全组织切成2×3mm的小块，分别在0.1％升汞液中表面消毒1min，在
75％乙醇中洗去升汞毒，灭菌水中连续浸洗3次，然后将小片组织放在灭菌玻皿内，加1ml灭菌水，用无菌玻棒捣碎，制成悬浮液1杯，放入第2个灭菌皿内1ml灭菌水中稀释，依次再稀释1次，共得3皿，每次倾入已溶化的并冷至45℃的牛肉汁-蛋白-琼脂培养基约10ml，立即与皿内悬浮液混合均匀，待冷却后，放入28℃温箱内培养，培养3天取出，从标本的第3皿内，选取具有本病特征的单菌落（菌落圆形、黄色、半透明、全绿），作划线培养，进一步纯化，再过两天，从划线培养中，选取单菌落，移植于试管斜面上，作为供试菌种。

　4.1.2.3 格兰氏染色

　4.1.2.3.1 格兰氏染色反应：菌种在B、P、A试管斜面28℃培养24h，用灭菌水制成悬浮液，涂片，同一玻片涂一条枯草杆菌作对照菌，涂片干燥后用胡凯氏法染色。

　4.1.2.3.2 形态鉴定

　　a. 大小，菌种在B、P、A试管斜面28℃培养24h，用灭菌水制成悬浮液，涂片，干燥后用石碳酸夫红染色，油镜下镜检并测定50个菌体。

　　b. 鞭毛染色，菌种在B、P、A试管斜面培养14～18h，用灭菌水制成悬浮液涂片，干燥后用硝酸银染色。

　　有条件的地方可进行生理生化和接种鉴定。

　4.2 出证，经田间检查和必要的室内检查，未发生黄龙病和溃疡病的苗木可签发产地检疫合格证，准予出圃。